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Como realizar um ensaio de ELISA

Um ELISA ou enzima ligada immunoabsorbent ensaio, é uma técnica de laboratório bioquímico feita para detectar um antígeno (como uma proteína) ou anticorpo em uma amostra experimental. O teste leva vantagem de ligação do anticorpo-antígeno e pode ser usado para outras células e mecanismos de ligação molecular também o doseamento. Em um teste de ELISA baseado em proteína, um anticorpo “captura” ou proteína é prevista em um prato de ensaio e permissão para aderir no prato, após o qual o agente “probe” (como sua proteína do interesse) é previsto e incubado com o agente de captura. Depois de várias lavagens, é adicionado um anticorpo “detecção” para visualizar a presença ou ausência de ligação do anticorpo-antígeno ou proteína-proteína.

Dificuldade: Moderadamente desafiador

Instruções

Coisas que você precisa

  • Prato de ensaio (por exemplo, bloco de 96 poços)
  • Captura de anticorpos (diluído a 5 µ g/mL em 50 mM NaHCO2, pH 9,6)
  • Sonda anticorpo/proteína (diluída para diferentes concentrações)
  • Anticorpo de detecção (por exemplo, rábano acoplados à peroxidase anticorpo)
  • PT reserva (PBS 1x, 0,05% Tween-20)
  • (1 X PBS com BSA ou 5 por cento de 5 mg/mL de leite desnatado em PBS 1x) tampão de bloqueio
  • Reagente de detecção (ie. Mistura de reagente TMB)
  • Agitador de laboratório mecânica
  • Quarto frio ou geladeira
  • Pipetter e dicas
  1. Diluir captura anticorpo a 5 µ g/mL em 50 mM NaHCO2 (pH 9,6). Adicione uL 50 a cada poço do prato de amostra usado para teste. Cobrir com plástico ou alumínio e incubar durante uma noite a 4 graus c num agitador do tipo.
  2. Despejar fora captura anticorpo e lavar duas vezes com 200 uL PT buffer. Adicione 200 uL de tampão de bloqueio por cavidade (PB ou 5 por cento leite desnatado). Incubar em qualquer lugar de duas horas durante a noite e agitando a 4 graus c.
  3. Despejo de tampão de bloqueio e lavar 4 vezes com 200 uL PT buffer. Adicione “probe” amostras da proteína em várias concentrações em PB ou 5 por cento leite desnatado, adicionando 100 uL por alvéolo. Incubar durante uma hora, agitando a 4 graus c. despejo de soluções da sonda e lavar seis vezes com 200 uL PT buffer.
  4. Adicionar a detecção do anticorpo (anticorpo conjugado HRP) diluído a 1:4000 em PB buffer ou 5 por cento de leite desnatado (cada um contendo 0,05% Tween-20), adicionando 50 uL por exemplo bem. Faça a incubação durante 30 minutos a uma hora, agitando a 4 graus c.
  5. Despejo fora solução de anticorpo de detecção e lavar 6 vezes com 200 uL PT reserva por poço, seguido de lavar duas vezes com 200 uL de 1x PBS (tampão fosfato salino). Despejar fora PBS e adicionar 100 uL do reagente de detecção por poço (para HRP, uso misturado na hora TMB reagente através da mistura de substrato TMB e peróxido de 1:1). Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente, agitando ocasionalmente.

    Ao usar o OST e HRP: finalmente, adicione uL 100 de 1 M H3PO4 (ácido fosfórico) por poço para saciar a reação TBM.

    Placa de leitura usando o leitor de análise da amostra, tais como um leitor de placas de 96 poços. (Para HRP e OST, utilize o modelo de “Ensaio de ponto final de ELISA” disponível na maioria dos leitores).

Dicas & advertências

Recentemente misturar o substrato TBM e peróxido e manter os componentes separados e a 4 graus C, antes a mistura e uso.

Enquanto o buffer de PB ou 5 por cento de leite desnatado pode ser usado como um tampão de bloqueio, ser consistente em utilizar um ou outro durante todo o ensaio inteiro.

Ácido fosfórico (H3PO4) é corrosivo e perigoso; usar luvas e cuidado extra ao manusear este.

Termos entrantes da busca:

  • tetradion@lublin mm pl loc:PT

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